脂肪细胞衍生的外泌体miR-27a通过抑制PPARγ在骨骼肌中诱导胰岛素抵抗
栏目:最新研究动态 发布时间:2018-06-11
脂肪细胞衍生的内分泌因素促进骨骼肌胰岛素抵抗的机制尚未完全了解。miR-27a在前驱糖尿病和T2DM肥胖患者的血清中高度表达......

Theranostics: 脂肪细胞衍生的外泌体 miR-27a 通过抑制 PPAR γ在骨骼肌中诱导胰岛素抵抗

脂肪细胞衍生的内分泌因素促进骨骼肌胰岛素抵抗的机制尚未完全了解。 miR-27a 在前驱糖尿病和 T2DM 肥胖 患者的血清中高度表达,主要由脂肪组织衍生。因此,由脂肪组织分泌到循环中的 miR-27a 可以调节骨骼肌中的胰岛素抵抗。近日,发表在《 Theranostics 》( IF:8.766 )的文章《 Adipocyte-Derived Exosomal MiR-27a Induces Insulin Resistance in Skeletal Muscle Through Repression of PPARγ 》探究了在肥胖幼年高脂饮食诱导的 miR-27a 敲减肥胖小鼠, db/db 小鼠和过表达 miR-27a C2C12 细胞中 miR-27a 与骨骼肌胰岛素抵抗之间的关联。通过棕榈酸酯处理的 3T3-L1 脂肪细胞制备的条件培养基孵育 C2C12 细胞来测定外泌体 miR-27a 介导的脂肪组织和骨骼肌之间的信号通讯。研究人员发现肥胖幼年小鼠血清 miR-27a 水平与肥胖和胰岛素抵抗呈正相关,并且血清 miR-27a 水平与 瘦素受体缺陷型 db/db 小鼠的胰岛素抵抗和肥胖和胰岛素抵抗相关,同时与高脂饮食喂养的 C57BL/6J 小鼠肥胖和胰岛素抵抗相关。从高脂饮食喂养的 C57BL/6J 小鼠的脂肪细胞释放的 miR-27a 与甘油三酯积累有关。来源于这些脂肪细胞的 miR-27a 通过 miR-27a 介导的对 PPAR γ及其下游基因的抑制来参与肥胖发展,在 C2C12 骨骼肌细胞中诱导胰岛素抵抗。

技术路线

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实验结果

1、 血清中 miR-27a 水平与肥胖诱导的胰岛素抵抗有关


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图一 血清 miR-27a 与肥胖儿童 进行性全身胰岛素抵抗有关,并且在高脂饮食喂养的小鼠和 db / db (瘦素受体缺陷型)小鼠中血清 miR-27a 水平升高。

A) 肥胖( OB )和正常体重( NW )儿童的血清中的 miR-27a 水平, miR-27a 在肥胖儿童的血清中升高;

B )血清 miR-27a 水平与 BMI 之间的相关性;

C )血清 miR-27a 水平与空腹血糖之间的相关性;

D HF (高脂饮食)和 LF (低脂饮食)喂养的小鼠 2 4 8 12 周时体脂肪分布百分比;

E HF LF 组血清中 miR-27a 的相对表达;

F HF 组和 LF OGTT (口服葡萄糖耐量试验)曲线下面积;

G HF 组和 LF ITT (胰岛素耐量试验)曲线下面积;

H db / db 小鼠的体重显著高于 db / m 小鼠

I db / db 小鼠的 Lee’s 指数显著高于 db / m 小鼠;

J db / db 小鼠的空腹血糖显著高于 db / m 小鼠;

K db / db 小鼠血清中 miR-27a 的相对表达显著高于 db / m 小鼠;

L db / m db / db 小鼠的 OGTT 曲线下面积。


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图二 在高脂饮食喂养的小鼠中,敲减 miR-27a 降低了血清 miR-27a 水平并且改善了葡萄糖和胰岛素耐受性,但是不提高体脂肪百分比分布。

A )低脂饮食 + 空载体小鼠( LF + EV ),高脂饮食 + 空载体小鼠( HF + EV )和高脂饮食 + miR-27a 敲减小鼠的脂肪百分比;

B )各组血清 miR-27a 的相对表达,其中高脂饮食 + 空载体小鼠表达量最高;

C )各组 OGTT 曲线下面积,与 LF+EV 组相比, HF+EV HF+miR-27a(-) 都更高;

D )各组 ITT 曲线下面积,与 HF+EV 相比, HF+EV HF+miR-27a(-) 显著升高。

2、 MiR-27a 通过 PPAR γ抑制作用损害骨骼肌中的胰岛素信号传导


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图三 miR-27a 促进骨骼肌中的胰岛素抵抗。

A )第 2 4 8 12 LF HF 小鼠骨骼肌中的 miR-27a 水平;

B 12 周时 LF HF 小鼠中 IRS-1 Akt GLUT4 mRNA 表达;

C 12 周时用胰岛素处理( + )或未处理( - )的 LF HF 小鼠骨骼肌中 p-IRS-1 IRS-1 p-Akt Akt GAPDH 的蛋白质表达;

D LF + EV HF + EV HF + miR-27a - )小鼠骨骼肌中 miR-27a 水平;

E LF + EV HF + EV HF + miR-27a - )小鼠中 IRS-1 Akt GLUT4 mRNA 表达;

F LF + EV HF + EV HF + miR-27a - )小鼠骨骼肌中 p-IRS-1 IRS-1 p-Akt Akt GAPDH 的蛋白质表达。

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图四 miR-27a 通过靶向 PPAR γ来减少 C2C12 细胞中的葡萄糖消耗。

A )对照(黑色), miR-27a + )(空白), miR-27a + 罗格列酮(灰色)和罗格列酮(阴影) C2C12 细胞中 miR-27a 的表达;

B )上述 C2C12 细胞中的葡萄糖消耗;

C )用( + )或不用( - 100nM 胰岛素温育 30 分钟的上述 C2C12 细胞中的葡萄糖摄取。与与对照相比,胰岛素刺激未能增加 miR-27a + )细胞中的葡萄糖摄取;

D )通过预测靶扫描, mmu-miR-27a-3p PPAR γ 3'UTR 318-325 位的序列互补;

E miR-27a PPAR γ的荧光素酶报道试验结果显示, miR-27a 通过与野生型 PPAR γ 3'UTR 序列结合显著降低荧光素酶密度,而突变型 PPAR γ 3'UTR 没有发现减少。


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图五 miR-27a 通过 PPAR γ抑制作用损害骨骼肌中胰岛素介导的信号转导。

A-C PPAR γ在 12 LF HF 小鼠骨骼肌中的 mRNA 和蛋白质表达,与 LF 小鼠相比, HF 小鼠骨骼肌中 PPAR γ的 mRNA 和蛋白质表达较低;

D-F LF + EV HF + EV HF + miR-27a - )小鼠骨骼肌中 PPAR γ的 mRNA 和蛋白表达, HF 小鼠中 miR-27a 敲减增加了 PPAR γ的 mRNA 和蛋白质表达;

G-J )罗格列酮治疗部分增加过表达 miR-27a 的细胞中的 PPAR γ mRNA 和蛋白质表达;

K-L )罗格列酮治疗增加了过表达 miR-27a 的细胞中胰岛素刺激的 p-IRS-1 蛋白及其下游 p-Akt 蛋白表达。

3、 负载脂质的脂肪细胞(但不是巨噬细胞)会将 miR-27a 分泌到外泌体中


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图六 HF 饮食喂养的小鼠的脂肪细胞释放 miR-27a ,棕榈酸酯处理的 3T3-L1 脂肪细胞分泌 miR-27a

A LF HF 小鼠在 2,4,8 12 周的内脏脂肪组织中 miR-27a 的相对表达,与 LF 喂养的小鼠相比,喂食高脂肪饮食 2 周的小鼠的内脏脂肪组织中的 MiR-27a 表达增加;

B db / m db / db 小鼠的内脏脂肪组织中 miR-27a 的相对表达,与 db / m 小鼠相比, db / db 小鼠在内脏脂肪中表现出 miR-27a 的较低表达;

C LF + EV HF + EV HF + miR-27a - )小鼠的内脏脂肪组织中的 miR-27a 水平,在喂食 HF 的小鼠中 miR-27a 敲减导致内脏脂肪组织中 miR-27a 水平降低;

D-F )与对照( Con )相比,在棕榈酸盐处理的细胞( Pal )中观察到脂质积累的增加 , TAG 浓度也增加;

G )与对照相比,棕榈酸酯处理的 3T3-L1 细胞中的 miR-27a 表达较低;

H )棕榈酸盐处理的细胞上清液中 miR-27a 水平比对照细胞高 2.7 倍。


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图七 负载脂质的脂肪细胞衍生的 miR-27a 在外泌体中分泌。

A )在 2,4,8 12 周的 LF HF 小鼠的血清中的 FABP4 浓度;

B -C )与 LF 小鼠相比,血清外泌体为 FABP4 阳性,并且来自 HF 小鼠血清的这些外泌体中的 miR-27a 积累较高;

D )从对照或棕榈酸处理的表达 miR-27a 3T3-L1 细胞上清液中提取的外泌体中的 MiR-27a 水平。与对照相比,用棕榈酸酯处理 3T3-L1 细胞将 miR-27a 释放到上清液中;

E )在用棕榈酸盐处理的过表达 miR-27a 3T3-L1 细胞的上清液中, miR-27a FABP4 共定位;

F )在不存在或存在 0.3mM 棕榈酸酯的情况下温育 48 小时的来自 3T3 细胞的外泌体的扫描电子显微照片;

G )外泌体标记物 CD63 存在上述细胞中;

H )上述细胞外泌体中 miR-27a 的表达,棕榈酸酯处理后表达增强。

4、 脂肪细胞衍生的外泌体 miR-27a C2C12 骨骼肌细胞摄取


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图八 C2C12 细胞摄取脂肪细胞分泌的外泌体 miR-27a

A )与 LF 小鼠相比, HF 的骨骼肌裂解物中 FABP4 蛋白的表达增加;

B )在 C2C12 细胞与 CM1 (对照)或 CM2 (棕榈酸酯处理)培养基孵育 48 小时后,上清液中的 FABP4 降低;

C )与 CM1 CM2 孵育后 C2C12 细胞中的 FABP4 浓度;

D )在 C2C12 细胞与 CM1 CM2 培养基孵育 48 小时后,上清液中 miR-27a 水平降低;

E )在用对照或棕榈酸处理的 3T3-L1 细胞(其中 miR-27a 被敲除)制备的条件培养基中,与 CM1 相比, CM2 孵育的 C2C12 细胞中 miR-27a 水平升高;

F )与对照相比,用棕榈酸酯处理的脂肪细胞的上清液孵育的 C2C12 中的荧光强度更大。

5、 脂肪细胞衍生的 miR-27a 在骨骼肌细胞中积累,并且通过阻抑 PPAR γ而损害胰岛素信号传导


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图九 脂肪细胞衍生的 miR-27a 增加 miR-27a ,并且损害 C2C12 细胞中的胰岛素信号传导。

A-B CM1 处理的细胞相比, CM2 处理的 C2C12 细胞的葡萄糖消耗,葡萄糖摄取和胰岛素刺激的葡萄糖摄取降低;

C-D CM1 组相比, CM2 组中观察到 PPAR γ mRNA 和蛋白质水平的明显降低, CM1 组通过 CM2 组中的 miR-27a 敲减而恢复;

E-F CM1 处理的细胞相比, CM2 处理的 C2C12 细胞中 PPAR γ, IRS-1 GLUT4mRNA 表达降低,并且胰岛素刺激的 p-IRS-1 p-AKT 降低

结论

综上所述,这些结果确定了脂肪组织和骨骼肌之间在胰岛素抵抗发展过程中的新型交叉通讯信号通路,并且表明脂肪组织来源的 miR-27a 可能在肥胖引发的骨骼肌胰岛素抵抗发生中起关键作用。