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DNA甲基化检测8折优惠(BSP,MSP等)

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区: 上海
简介: BSP,MSP,HRM,焦磷酸测序,DNA甲基化分析
提供商: 上海英拜生物科技有限公司
服务名称: DNA甲基化分析(BSP,MSP等)

DNA甲基化整体解决方案

一、 结合重亚硫酸盐的测序法实验流程(BSP) (Bisulfite Genomic Sequence)

原理:结合重亚硫酸盐的测序法是一种灵敏的能直接检测分析基因组DNA甲基化模式的方法。重亚硫酸盐处理后,用针对改变后的DNA序列设计特异性引物并进行聚合酶链式反应(PCR)。 PCR产物中原先非甲基化的胞嘧啶位点被胸腺嘧啶所替代,而甲基化的胞嘧啶位点保持不变。PCR产物克隆后进行测序。通过这个方法能得到特定位点在各个基因组DNA分子中的甲基化状态。

该方法特点是:
1. 特异性高,它能够提供特异性很高的分析结果,这是所有其他研究甲基化的分析方法所不能比拟的;
2. 灵敏度高,可以用于分析少于100个细胞的检测样品。用微量的基因组DNA进行分析就能得到各个DNA分子精确的甲基化位点分布图。

图1 结合亚硫酸盐的测序法流程图
DNA用重亚硫酸盐处理后进行PCR扩增,扩增片段纯化后连接进载体,转化大肠杆菌,过夜培养后挑单个阳性克隆进行测序。得到每个DNA分子特定区域甲基化位点的分布图。

结合重亚硫酸盐测序法技术实验流程
A.DNA制备
用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B.重亚硫酸盐处理
C.DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D.DNA脱磺基反应
E.PCR扩增
F.PCR产物琼脂糖电泳后回收纯化,随后连接到pGEM-T EASY 载体中克隆及测序。

二、甲基化特异性 的PCR实验流程
(methylation-specific PCR, MSP)


原理:甲基化特异性的PCR是一种灵敏度高且操作相对简单的甲基化研究方法。重亚硫酸盐处理DNA后,基因组DNA发生的由甲基化状态决定的序列改变。随后进行引物特异性的PCR。该方法引物设计是关键。MSP中设计两对引物,即一对结合处理后的甲基化DNA链(引物对M),另一对结合处理后的非甲基化DNA链(引物对U)。检测MSP扩增产物,如果用引物M能扩增出片段,则说明检测位点存在甲基化;若用引物U扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化(图3)。

该方法优点是:
1、检测灵敏度高,样品消耗少,仅需1μg的基因组DNA,可用于石蜡包埋样本;
2、快速、简单,省时;
3、如果结合Real-time定量PCR技术(Taqman 探针)则能对样品中检测位点的甲基化水平进行定量检测(Methylight)。

图2 甲基化特异性的PCR(MSP)流程示意图
用亚硫酸盐处理后DNA分子发生了由甲基化状态决定的序列改变。用甲基化特异性的引物(primer M)和非甲基化特异性的引物(primer U)进行扩增。只有结合完全的甲基化或

MSP 技术实验流程
A.DNA抽提
用DNA抽提试剂盒(Promega, cat. no. A1125)抽提组织,细胞培养物,石蜡包埋组织切片样品中的基因组DNA。
B. 重亚硫酸盐处理
C.DNA纯化
用Wizard DNA clean-up kit (Promega, cat. no. A7280)纯化重亚硫酸盐处理后的DNA样品。
D.DNA脱磺基反应
E.甲基化特异性的PCR反应
针对改变后的DNA序列设计两对引物(M,U),进行PCR反应。为了避免非特异性扩增用TaKaRa的hotstart酶。随后对PCR产物的凝胶电泳图进行分析。
实例:
检测肝癌细胞株Bel7405,Bel7404中SFRP1基因启动子甲基化。重亚硫酸盐处理后,针对改变的DAN序列设计两对引物
M: (forward: AGTTAGTGTCGCGCGTTC; reversal: CCGATACCCATACCGACTC) 299 bp
U:(forward:GGAGTTGGGGTGTATTTAGTTTG; reversal: CCAATACCCATACCAACTCTACA) 247 bp

图3:PCR扩增结果图


三、高分辨率熔解曲线(HRM)法

高分辨率熔解曲线分析技术(High Resolution Melting ),简称HRM ,是近年来兴起的一种检测基因突变、进行基因分型而及甲基化检测的新方法。基本原理是基于核酸分子由于片段长短、GC含量、GC 分布及单个碱基差异等物理性质不同而造成DNA 分子在加热变性时都会有不同的熔解曲线的形状和位置,并配合运用高浓度的饱和荧光染料,可以迅速的检测出核酸片段中GC含量和单碱基的突变。近年来,公司引进了Roche LightCycler® 480 II 和ABI VIIA7 全自动荧光定量PCR系统,为客户提供专业化、个性化的甲基化HRM检测服务。

操作流程:
﹡待测基因序列片段或位点甲基化引物设计(300bp以内)。
﹡利用甲基化转移酶修饰的DNA和非甲基化修饰的DNA制备标准品(0%,1%,5%,10%,20%,50%,100%梯度HRM标准曲线)
﹡亚硫酸氢盐处理样品DNA
﹡上机检测
﹡数据处理,形成报告(包括实验过程、试剂耗材、荧光PCR仪原始文件、测序文件等)。

实验实例:
对2个病例的某基因20个CG位点进行检测,分析出不同的甲基化程度。

四、焦磷酸测序法

焦磷酸测序(Pyrosequencing)技术是由4种酶(DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sulfurytase)、荧光素酶(luciferase)和三磷酸腺苷双磷酸酶(Apyrase))催化的同一反应体系中的酶级联化学发光反应。每一轮测序反应体系中只加入一种脱氧核苷酸三磷酸(dNTP)。如果该dNTP与模板配对,则会在DNA聚合酶的作用下,添加到测序引物的3'末端,同时释放出一个分子的焦磷酸(PPi)。掺入的dNTP和释放的PPi是等量的。CpG甲基化焦磷酸测序检测法基于引物延伸的Pyrosequencing技术,通过将链合成过程中释放出的焦磷酸(PPi)转化成光信号来监测链的合成过程。通过检测CpG对应位点上C/T渗入的比例对目标位点的甲基化程度进行定量分析方法。

操作流程:
﹡DNA亚硫酸盐处理
﹡用焦磷酸测序专门引物设计软件设计甲基化引物
﹡进行PCR扩增预实验及正式实验
﹡PCR产物上焦磷酸测序仪检测

实验实例:

各种方案比较

服务说明

①样品要求:
﹡血液样品:样品为EDTA抗凝或枸椽酸钠抗凝,样品量大于0.5 ml,样品采集后于-20℃或-80℃保存,低温(≤-4℃)运输。
﹡组织样品:样品可以为新鲜组织(最好-80℃保存)或石蜡包埋的组织,也可以是95%乙醇中固定的组织,组织量大于100 mg。
﹡DNA样品:纯度OD260/280 比值为1.8-1.9,浓度≥50ng/ul,体积≥50ul。
②提供详细的基因信息
BSP方法要求待测序列≤300bp,HRM待测序列≤200bp,HRM待测序列≤200bp,焦磷酸测序待测序列≤60bp,且上下游保留200bp用于引物设计;MS方法要求提供待测序列的CG侯选位点。我们会根据客户的基因序列信息选择不同的检测方法,并在方案实验过程中随时与客户沟通。
③提供结果
实验报告(实验步骤,包括BSP法的5个克隆统计结果等)、PCR电泳照片、测序彩色波形图、HRM标准曲线图、焦磷酸测序原始文件、基因芯片的原始文件等。

上海英拜生物科技有限公司
官网: http://www.yingbio.com/
给我们留言: http://www.yingbio.com/feedback.asp

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