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microRNA整套技术服务(靶基因功能验证服务,报告基因载体,过表达载体,稳转细胞株等等)

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microRNA 靶基因验证实验

当前,microRNA对靶基因的功能研究十分热门。利用荧光素酶报告基因检测实验寻找或验证microRNA对靶点作用性是不可或缺的实验技术。英拜生物可为您提供microRNA报告基因载体构建服务,并可进一步为您提供荧光素酶报告基因检测实验服务。您只需要提供目的microRNA靶位点序列,本公司专业技术服务人员就可替您完成载体构建,为您节省大量的时间和精力。
下图为microRNA-reporter载体表达框架示意图,具有多克隆位点,方便插入目的靶点序列。psiCHECK-2载体用于终点法的细胞裂解物检测,包含萤火虫荧光素酶基因,使海肾荧光素酶的表达水平归一化,令该系统更可靠、重现性更好。使用psiCHECK-2载体时,无须通过共转染进行归一化。


英拜生物microRNA报告基因实验流程:
  1. microRNA靶点的预测

利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列(客户提供)。
  1. 获得microRNA靶点序列

根据提供的靶序列,合成两条互补的单链DNA模板。或者,设计引物PCR扩增目的microRNA靶基因3’UTR序列。
  1. microRNA靶序列克隆

将合成的两条单链退火成双链(具有粘性末端),或将PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的miR-reporter载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α。
  1. 阳性克隆鉴定。

挑选转化的菌落,PCR筛选含有插入片段的阳性克隆,测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
  1. 细胞转染准备

将含目的microRNA靶基因的报告基因载体、内参质粒和microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
  1. 荧光素酶检测

共转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,确定目的microRNA的靶基因。
  1. 突变实验

构建miR-reporter载体(含突变靶位点的荧光素酶报告基因载体)与内参质粒、microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。共转染细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,进一步验确定目的microRNA的靶基因。
  1. 整理分析数据,得出结论。

提供有microRNA靶序列的报告质粒,以及内参和对照质粒各一份。甘油保存菌株各一支。附mir-reporter载体的说明书,以及实验报告,包括载体构建过程,鉴定记录,测序报告,细胞转染,荧光检测。



注:
microRNA mimics与microRNA negative control由客户提供或由本公司代购(Dharmacon公司),也选用Pre-miR 与Pre-miR negative control(Ambion)或构建microRNA过表达载体及对照载体(本公司可以构建)。

MicroRNA 功能学实验

  • 细胞增殖试验

  • 细胞凋亡试验

  • 细胞周期试验

  • 细胞侵袭试验

  • 细胞迁移试验

服务流程:

构建过表达microRNA载体以及对照载体或客户提供人工合成寡核苷酸→转染细胞系→qRT-PCR检测目的MicroRNA前体的表达情况→分析目的MicroRNA与细胞增殖、细胞凋亡、细胞周期、细胞侵袭、细胞迁移之间的调控关系→出具书面报告,qRT-PCR分析的原始数据

客户提供:

MicroRNA前体(Ambion公司)或mimic 与寡核苷酸(即对照前体或control mimic)及细胞系。

公司提供:

MicroRNA表达载体的质粒、质粒测序图、qRT-PCR分析的原始数据、结果分析的书面报告。

miRNA 表达检测

定量检测组织或细胞样本中的miRNA是功能研究的第一步,有助于人们进一步了解 miRNA与疾病发生及发展的关系,以便为疾病的早期诊断提供新的思路。本公司主要通过microRNA芯片、microRNA-Seq、microRNA PCR 芯片、实时定量PCR、原位杂交等多种方法检测miRNA的表达情况。为您提供最优质的、全方位的技术服务。

1、microRNA芯片检测服务 http://www.biomart.cn/infosupply/7484330.htm

2、 microRNA PCR芯片检测服务 http://www.biomart.cn/infosupply/10966567.htm

3、microRNA-Seq检测服务 http://www.biomart.cn/infosupply/9632788.htm

4、microRNA定量PCR http://www.biomart.cn/infosupply/7484332.htm

miRNA芯片,microRNA-Seq数据深度发掘分析

a) 芯片,测序数据聚类分析

b) microRNA靶基因预测“TargetScanS”, “miRanda (miRBase)”,“miRGen”等数据库

预测差异microRNA的所有靶基因。

c) 靶基因GO分析

根据Gene Ontology数据库对靶基因进行功能显著分析,从而筛选显著性功能的靶基因。

d) 靶基因pathway分析

根据KEGG数据库对靶基因进行Pathway分类,并进行显著性分析从而得到显著性的Pathway分类。

e) 构建的MicroRNA与基因的调控网络

通过构建MicroRNA与基因的调控网络,可以从中找出hub基因及hub microRNA.

f) microRNA 、靶基因、转录因子调控网络

microRNA也会受到转录因子调控造成表达差异,通过系统研究转录因子与基因间的调控关系,可以为寻找重要转录因子及重要基因提供线索。

g) microRNA启动子分析及甲基化位点分析

当microRNA研究日趋火热,越来越多的研究者开始关注microRNA本身甲基化变化。MicroRNA基因的甲基化变化也是造成microRNA表达差异的重要原因。

资料下载: microRNA靶基因验证实验.pdf 附件下载 miRNA荧光定量PCR技术服务.pdf 附件下载

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