原位杂交实验

原位杂交实验
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原位杂交( in situ hybridization, ISH)是用标记的DNA或RNA为探针,根据碱基互补配对原则,在原位检测组织细胞内特定核酸序列的方法。根据探针的标记物是否直接被检测,原位杂交可分为直接法和间接法。直接法主要用放射性同位素、荧光及某些酶标记的探针与靶核酸进行杂交,通过放射自显影、荧光显微镜术或成色酶促反应直接显示。间接法用半抗原标记探针,通过免疫组织化学法对半抗原定位,间接显示探针与靶核酸形成的杂交体。 非放射性标记的原位杂交具有安全、经济、灵敏度高等优点,因而生物素标记探针digaoxin标记探针迅速发展。
标记探针迅速发展。

1 、原位杂交(digaoxin)实验流程

  1. 蛋白酶K处理

  2. 预杂交

  3. 探针变性

  4. 杂交

  5. 洗涤

  6. 消化残余的RNA

  7. 封闭液封闭30min。

  8. 抗体孵育1~2h。

  9. 洗涤

  10. 显色BCIP/NBT显色液加至标本上避光显色20min。若无背景出现可继续显色过夜。

  11. 核固红复染,充分自来水冲洗。

  12. 梯度乙醇脱水,二甲苯透明,中性树脂封片,光镜观察拍照。



2 、荧光原位杂交实验流程( FISH
1、脱蜡
2、蛋白酶处理
3、变性
4、杂交
5、杂交后水洗
6、检测
7、扩增
8、DAPI封片,荧光显微镜拍照。




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