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microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因验证实验

microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因验证实验
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microRNA-circRNA(lncRNA) 靶基因验证实验

环状RNA(circRNA)和长链非编码RNA(lncRNA)是一类非编码RNA,不翻译蛋白。但在细胞中它们能够调控其他基因的表达变化。近年的研究表明circRNA和lncRNA分子富含microRNA结合位点,在细胞中起到miRNA海绵(miRNA sponge)的作用,进而解除miRNA对其靶基因的抑制作用,升高靶基因的表达水平,这一作用机制被称为竞争性内源RNA(ceRNA)机制。因此,通过与疾病关联的miRNA相互作用,circRNA和lncRNA在疾病中发挥着重要的调控作用。研究cirRNA、lncRNA的调控机制需要先找到与cirRNA、lncRNA相互作用的miRNA,而荧光素酶报告基因实验可以用来证明miRNA与circRNA, miRNA与lncRNA的直接相互作用。



英拜生物microRNA报告基因实验流程:
1.  microRNA靶点的预测
利用Targetscan,miRanda,PicTar软件得到目的microRNA的预测靶点序列。
2.  获得microRNA靶点序列
根据提供的靶序列,合成两条互补的单链DNA模板。或者,设计引物PCR扩增microRNA靶基因序列(lncRNA,circRNA全长序列或靶标序列)。
3.  cirRNA靶序列克隆
将合成的两条单链退火成双链(具有粘性末端),或将PCR产物双酶切,后连入经过同样双酶切的Psicheck-2载体中,连接产物转化大肠杆菌DH5α。
4.  阳性克隆鉴定。
挑选转化的菌落,PCR筛选含有插入片段的阳性克隆,测序验证克隆的序列和目的microRNA靶序列一致。
5.  细胞转染准备
将psicheck-2报告基因载体、microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞。
6.  荧光素酶检测
报告基因载体与microRNA mimics或microRNA negative control共转染293T或Hela细胞24-72h后,进行双荧光素酶检测,确定目的microRNA的靶基因。
7.  整理分析数据,得出结论。
提供有microRNA靶序列的报告基因质粒、甘油保存菌株各一支。附实验报告,包括载体构建过程,鉴定记录,测序报告,细胞转染,荧光检测。





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